Detaljerad information för diarienr  2006-714  
 
 
Ämnesområde:
Biologisk mångfald
Beslutsdat:  2006-11-16
Namn:
Ericson, Per
Titel:  Doktor
Kön:  Man
E-post: Per.Ericson@nrm.se
Univ./Institution: Naturhistoriska riksmuseet - Forskningsavdelningen
Projekttitel (sv): En DNA-nyckel till alla Sveriges ryggradsdjur.
Projekttitel (eng): A DNA key to all Swedish vertebrates.
Värdhögskola: Naturhistoriska riksmuseet
SCB-klassificering: Systematik och fylogeni, Molekylärbiologi, Bioinformatik
Beviljat (SEK): Bidragsform   2007 2008 2009      
  Projektstöd   848700 1012000 713000      
Beskrivning: Alla organismer har unikt DNA. Genom att jämföra DNA-sekvenser från en viss individ med en referensdatabas, kan man avgöra vilken art den tillhör. Målet med denna ansökan är att delta i ett världsomspännande arbete med att skapa en sådan referensdatabas för all världens växter och djur. Detta sker inom Consortium for the Barcode of Life (CBOL), som grundades 2004, är en internationell sammanslutning bestående av 100 organisationer (museer, universitet, botaniska och zoologiska trädgårdar mm) från 39 länder. För djur har man bestämt att deponera DNA-streckkoder från den mitokondriella COI-genen för alla arter i ett gemensamt arkiv, som är sökbart via internet. Alla sekvenser som tas fram skall kopplas till beläggexemplar i offentliga samlingar, och rådata skall också göras tillgängliga. De höga kvalitetskraven skiljer DNA-streckkodningen från de redan befintliga DNA databaserna. Genom bevarade beläggexemplar kan man i efterhand kontrollera artbestämningar. Sparade och allmänt tillgängliga rådata från sekvenseringarna kommer göra det möjligt att bedöma kvaliteten hos de deponerade sekvenserna. Målsättningen att sekvensera samma gen för alla organismer kommer även att leda till att DNA-streckkodning blir ett effektivt taxonomiskt verktyg. I Mellanamerika pågår redan arbete med att "DNA-screena" delar av insektsfaunan för att hitta arter som är okända för vetenskapen. Metoden ses som ett komplement till traditionell taxonomi och de formella artbeskrivningarna baseras på studier av morfologi och anatomi. DNA-streckkoder kommer tveklöst att väsentligt öka vår kunskap om jordens biodiversitet. Idag kräver tekniken tillgång till laboratorier. Men inom en inte alltför avlägsen framtid räknar man med att ha tillgång till bärbara scanners, som snabbt och säkert skall kunna analysera ett prov. Den här ansökan syftar till att inom ramen för CBOL producera DNA-streckkoder för alla Sveriges ryggradsdjur (>800 arter). Utöver att bidra till kartläggningen av den globala genetiska variationen hos ryggradsdjur kommer vi inom prjektet också att (1) skapa förutsättningar för att kunna identifiera djurdelar som omfattas av legal och illegal handel, används inom livsmedelproduktion, fiskerinäring etc.. Vi kommer också (2) utvärdera metodens eventuella begränsningar, (3) skapa en standard för framtida utveckling och användning av DNA-streckkoder i Sverige samt (4) framställa en handledning för insamlande och förvaring av beläggexemplar och DNA-prover.
Inomvetenskaplig redovisning: A DNA key to Swedish vertebrates ? scientific report

All species can be identified by unique DNA sequences. ?DNA barcoding? is a global initiative that aims to produce a catalogue of unique sequences for all the species of the world. DNA barcodes will allow non-specialists to accurately identify species, and since barcodes work on all life stages (eggs, sperm, seed, larvae), as well as on incomplete specimens or small fragments (food ingredients, forensic evidence, stomach contents), it can be used for a wide range of applications. Potential applications include food control, fisheries management and identification of products of animals and plants subject to restrictions in national and international trade (e.g., the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora, CITES).
The project ?Barcoding the Swedish Vertebrates? has been carried out between 2006 and 2011 at the Molecular Systematics Laboratory (Swedish Museum of Natural History). It focused on all vertebrates occurring regularly within the Swedish territory, i.e. mainland and adjacent waters. In accordance with the barcoding standards set out by the Consortium for the Barcode of Life (http://www.barcoding.si.edu), the COI gene has been selected as the principal barcoding marker. In addition, a portion of the 16S rRNA gene has been used as a secondary marker.
The aim with the project was to demonstrate the power and usefulness of DNA barcoding by producing a DNA identification key for all Swedish vertebrates that can serve as tool for identifying animal and plant products subject to trade (both legal and illegal), fisheries management, nutrient control, etc.
We obtained 1724 barcoding sequences representing 503 species of Swedish vertebrates (69 mammals, 264 birds, 4 reptiles, 6 amphibians and 160 fishes). The species included are those considered of regular occurrence within the Swedish territory and nearby waters, including alloctonous species with regular populations in Sweden. Vagrants, escapes or any other category of non-regular occurrence has been excluded. The sample coverage is good for mammals and birds only, rather good for fishes and poor for amphibians and reptiles. In particular, for mammals, birds and fishes, all common or rather common species have been included in the project. The missing birds are either rare, occurring in low number as migrants, winter or summer visitors. For mammals, only few bats and shrews, and one dolphin are missing. Amphibians and reptiles are the least sampled groups, reflecting the lack of a specific tissue collection in the museum. When multiple samples were available for a species, we selected the samples using three criteria: 1) presence of a voucher; 2) collection during the breeding season (birds only); 3) geographic origin.
We demonstrated the power and usefulness of DNA barcoding by producing a DNA identification key for 75% of all Swedish vertebrates (503 out of 657 species). We have also established a model for continued barcoding activities in Sweden, by developing guidelines for collection and for long-term storage of vouchers and material intended for DNA studies. The DNA sequences are being published on the NRM website where it is also possible to compare unknown sequences with this new library of sequences from Swedish vertebrates. We will also make available at the website a guide, directed to collectors and end-users and adapted for Swedish conditions, produced to specify conditions for obtaining high quality tissue and appropriate procedures for PCR, amplification, sequencing, alignment and storage of sequencer output, tissue and vouchers.

Two mitochondrial gene regions were used to produce DNA barcodes, the protein-coding cytochrome oxydase I (CO I) mitochondrial gene and 16S rRNA.

Sequencing COI in fishes. ? The sequencing proved to be easy and the published protocol by Ward et al. (2005) worked well. Ward et al. (2005) suggested four primers, a primary couple (FishF1 and FishR1), plus two alternative primers (FishF2 and FishR2). Only 5% of samples did not produce any amplification product, the same proportion observed by Ward et al. (2005) for Australian fishes.
Sequencing COI in amphibians and reptiles. ? The protocol of Smith et al. (2008) seems to be reliable, although the number of species tested is limited, only ten.
Sequencing COI in birds. ? The published protocols (Hebert et al. 2004) for birds proved to be unreliable and with poor repeatability. Instead, we developed a different strategy by designing bird specific primers annealing on the two flanking tRNA and used these to amplify the entire COI gene. With the new protocol we obtained sequences from all bird species. The entire dataset of the COI bird sequences has been submitted to www.barcodinglife.org.
Sequencing COI in mammals. ? Due to the lack of robust protocols, no sequencing was attempted for mammals. All attempts to use on mammals the published protocols for birds and fishes failed to produce good quality amplification products.
Sequencing 16S. ? The 16S rRNA gene proved to be an excellent marker with an exceptionally robust amplification protocol. The region amplified is a portion of the third domain spanning about 550 bp. We had problems in only two cases, one mammal and one bird. In all intraspecific comparisons, the genetic distances within species are null or very, very low. In general, almost all species can be identified using the 16S sequences alone. Thanks to the fact the stem regions are so conserved that few mutations exist among the vertebrates we designed a primer couple that can amplify a very short fragment of 120-140 bp in all vertebrates. It is especially useful when only short fragment can be amplified via PCR due to degraded DNA.

In order to test the reliability of the barcoding for identification of unknown samples, we selected a number of food products containing fishes in a local supermarket. The food was selected to include frozen but unprocessed fishes, caviar-type eggs, pickled fishes and prepared meals. For all samples we were able to amplify easily both 16S rRNA and COI genes. When compared with the barcoding database of Swedish fishes, for all food products the sequences matched closely the sequences of the species mentioned on the packaging.
A further testing of the possible barcoding application was offered by the analysis of a supposed food adulteration. A pack of flat fishes (Pleuronectes platessa) bought at an ICA supermarket was reported by a customer as containing fishes of two species. On consulting basis for the ICA company we analyzed the content of the package. It contained eight filets that indeed appeared morphologically different, three darker and five lighter. We extracted and sequenced samples obtained from all eight filets and compared the results with the barcoding database of Swedish fishes. All eight samples turned out belonging to the same species, Pleuronectes platessa, as stated on the package. The morphological differences between the two kind of filet reflects the asymmetry of flat fishes, with the light filet being the bottom side and the darker filet the upper side of the body!
The reliability of the 16S rRNA sequences as an identification tool has been tested with a group of bat samples belonging to two species difficult to identify morphologically, Myotis brandti and M. mystacinus. Some specimens were in poor condition or too young to be confidently identified. The sequencing proved that the 16S sequences are suitable to identify these bat species, with a minimal intraspecific variability.

Scientific publication:
Johnsen, A., Rindal, E., Ericson, P.G.P., Zuccon, D., Kerr, K.C.R., Stoeckle, M.Y. & Lifjeld, J.T. 2010. DNA barcoding of Scandinavian birds reveals divergent lineages in trans-Atlantic species. Journal of Ornithology, 151, pp. 568-578.
Populärvetenskaplig redovisning: En DNA-nyckel för svenska ryggradsdjur ? popuärvetenskaplig rapport

Alla organismer har unikt DNA. Genom att jämföra DNA-sekvenser från en viss individ med en referensdatabas, kan man avgöra vilken art den tillhör. Ett mål med projektet var att delta i det världsomspännande arbetet med att skapa en sådan referensdatabas för all världens växter och djur. Detta sker inom Consortium for the Barcode of Life (CBOL), som grundades 2004, är en internationell sammanslutning bestående av 100 organisationer (museer, universitet, botaniska och zoologiska trädgårdar mm) från 39 länder. För djur har man bestämt att deponera DNA-streckkoder från den mitokondriella COI-genen för alla arter i ett gemensamt arkiv, som är sökbart via internet. Alla sekvenser som tas fram skall kopplas till beläggexemplar i offentliga samlingar, och rådata skall också göras tillgängliga. De höga kvalitetskraven skiljer DNA-streckkodningen från de redan befintliga DNA databaserna. Genom bevarade beläggexemplar kan man i efterhand kontrollera artbestämningar. Sparade och allmänt tillgängliga rådata från sekvenseringarna kommer göra det möjligt att bedöma kvaliteten hos de deponerade sekvenserna. Målsättningen att sekvensera samma gen för alla organismer kommer även att leda till att DNA-streckkodning blir ett effektivt taxonomiskt verktyg. I Mellanamerika pågår redan arbete med att ?DNA-screena? delar av insektsfaunan för att hitta arter som är okända för vetenskapen. Metoden ses som ett komplement till traditionell taxonomi och de formella artbeskrivningarna baseras på studier av morfologi och anatomi. DNA-streckkoder kommer tveklöst att väsentligt öka vår kunskap om jordens biodiversitet. Idag kräver tekniken tillgång till laboratorier. Men inom en inte alltför avlägsen framtid räknar man med att ha tillgång till bärbara scannrar, som snabbt och säkert skall kunna analysera ett prov.
I detta projekt har vi, inom ramen för CBOL, producerat totalt 1724 DNA-streckkoder från 503 stycken av Sveriges arter av ryggradsdjur (69 däggdjur, 264 fåglar, 4 reptiler, 6 amfibier and 160 fiskar). Dessa arter representerar de som anses vara regelbundet förekommande inom svenskt landterritorium och angränsande vatten. Arter som förekommer ytterst sällsynt, är inplanterade eller av annat skäl har status som en icke naturlig del av faunan har uteslutits. Den taxonomiska täckningen är god för däggdjur och fåglar, ganska god för fiskar och svag för amfibier och reptiler. A däggdjur, fåglar och fiskar finns prover från alla vanliga och ganska vanliga arter. För däggdjur saknas endast ett par arter av fladdermöss och gnagare samt en art av delfin. För fåglar är de saknade arterna antingen sällsynta eller bara tillfälliga vinter- eller sommargäster. Skälet till att så få arter av amfibier och reptiler sekvenserats är att vävnadsprover av dessa av ovanliga på landets museer. Komplettering av sekvensdatabasen sker dock löpande när prover av saknade arter inkommer till museet. I de fall då flera olika prover av en art fanns att tillgå så valdes detta ut enligt följande kriterier: 1) förekomst av beläggexemplar; 2) insamling gjord under reproduktiva säsongen (endast för fåglar); och 3) geografiskt ursprung.
Utöver att skapa förutsättningar för att identifiera djurdelar som omfattas av legal och illegal handel, används inom livsmedelproduktion, fiskerinäring etc. har projektet också bidragit till kartläggningen av den genetiska variationen hos ryggradsdjur. Vi har också skapat en laboratoriestandard för framtida utveckling och användning av DNA-streckkoder i Sverige samt börjat utvärdera metodens begränsningar.
För att testa DNA-streckkodmetodens tillförlitlighet valdes olika fiskprodukter ut från frysdiskarna i en livsmedelsaffär. Såväl frysta, icke tillagade produkter som kaviar, inlagd fisk samt färdigprodukter utvaldes till testet. Både CO I och 16S sekvenser kunde amplifieras från samtliga matvaror. Dessa sekvenser jämfördes med vår nya DNA-nyckel för svenska ryggradsdjur. Resultatet visade att för alla matprodukter så överensstämde paketets innehållsförteckning med den faktiska råvaran.
I ett annat test lät vi utföra en undersökning på uppdrag från en ICA affär i norra Sverige. Skälet var anklagelser om fusk med råvaran från en kund som köpt en förpackning rödspotta (Pleuronectes platessa) men funnit att den innehållit filéer av två olika slags fiskar. Av de åtta filéerna härrörde tre från en mörk fisk och fem från en ljus fisk. Vi extraherade DNA från de åtta proverna, sekvenserade dem och jämförde sedan med referenssekvenserna i DNA-nyckeln för svenska ryggradsdjur. Alla åtta visade sig tillhöra just rödspotta, den art som angivits på förpackningen. Den upptäckta skillnaden mellan mörka och ljusa filéer kan förklaras av att rödspottan, likt alla plattfiskar, har en ljus undersida och mörkare översida.
Möjligheten till artbestämning av däggdjur undersöktes med hjälp av en grupp prover av fladdermöss som samlats in från vad som antogs vara två arter. Dessa båda arter, Brandts fladdermus Myotis brandti och mustaschfladdermus M. mystacinus, är mycket svåra att skilja åt på morfologisk grund. Sekvensering av 16S visade att deras DNA lätt kunde särskiljas och att inomartsvariationen är mycket liten.

Populärvetenskaplig publikation:
Källersjö, M. och Ericson, P.G.P. 2007. Global DNA-katalog ger nya möjligheter. Miljöforskning, 2/2007.